一种通过发夹结构变化介导的SRH级联等温放大辅助电化学生物传感器，用于检测单核细胞增生李斯特菌

　　摘要快速且灵敏地检测食源性病原体对于保障食品安全和公共健康至关重要。在本研究中，我们基于发夹结构构象变化介导的级联等温扩增策略，开发了一种电化学生物传感器，用于检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。该生物传感器利用适配体特异性识别目标细菌，结合磁分离技术将目标细菌的浓度转化为触发链的

　　快速且灵敏地检测食源性病原体对于保障食品安全和公共健康至关重要。在本研究中，我们基于发夹结构构象变化介导的级联等温扩增策略，开发了一种电化学生物传感器，用于检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。该生物传感器利用适配体特异性识别目标细菌，结合磁分离技术将目标细菌的浓度转化为触发链的浓度。触发链会引发发夹结构的构象变化，进而启动包括链置换扩增、滚环扩增和杂交链反应在内的级联扩增反应（SDA-RCA-HCR），实现信号呈指数级放大，同时显著降低因自身切割产生的背景信号。所设计的生物传感器对单核细胞增生李斯特菌的线 CFU/mL，检测限低至5 CFU/mL（信噪比为3）。该传感器对目标细菌具有很高的特异性，能够有效区分其他常见的食源性病原体，并在生菜、奶酪和鸡肉等实际食品样本中表现出良好的性能。因此，这项工作为在复杂食品基质中快速检测食源性病原体提供了一种高效、可靠且灵敏的新方法。

　　食源性病原体作为食品和水中的普遍污染物，一直威胁着人类健康，也是全球公共卫生面临的重要挑战[1,2]。根据世界卫生组织的估计，全球每年有超过6亿人患上食源性疾病，其中约70%的病例由致病微生物引起[3,4]。在众多食源性病原体中，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌被认为是相关疾病的主要致病菌[[5], [6], [7]]。单核细胞增生李斯特菌是一种革兰氏阳性细菌，能够承受高盐度、低氧浓度和低pH值等多种恶劣环境条件[8]。值得注意的是，它甚至能在冷藏温度下存活并繁殖，这也是其成为李斯特菌病致病菌的原因[9,10]。虽然李斯特菌病的发病率较低，但其致死率很高，在孕妇、新生儿和老年人等易感人群中的死亡率可高达20 - 30%[11,12]。该病的主要临床症状包括发热和头痛[13]，在严重情况下，感染还可能发展为脑膜炎、败血症，甚至导致死亡[14]。

　　目前用于检测食源性病原体的方法主要包括传统培养法、聚合酶链反应（PCR）[15]以及免疫测定法[16]（如ELISA）。尽管这些技术能够灵敏地检测目标病原体，但每种方法都存在一定的局限性：基于培养的方法耗时费力；PCR需要复杂的热循环仪器；而免疫测定法则容易发生交叉污染和假阳性结果[[17], [18], [19]]。因此，开发一种快速、灵敏、易于使用且成本较低的细菌检测方法，对于及时诊断和有效控制食源性疾病至关重要。

　　等温核酸扩增技术能够在恒定温度条件下进行扩增反应，无需热循环仪，从而避免了传统PCR对精确温度控制设备的需求[20]。迄今为止，包括链置换扩增（SDA）[21]、滚环扩增（RCA）[22]、杂交链反应（HCR）[23]、催化发夹自组装（CHA）[24]以及重组酶聚合酶扩增（RPA）[25]在内的多种INAATs已被广泛用于食源性病原体的检测。尤其是SDA，能够高效扩增目标短单链DNA[26]，通过熊猫体育赛事合作合理设计，其产物可作为引物启动后续的扩增反应，实现级联信号放大。卢等人开发了一种用于检测鼠伤寒沙门氏菌的双SDA方法，其检测限可达6 CFU/mL[27]。与SDA不同，RCA以环状DNA为模板，持续生成具有串联重复序列的长单链DNA[28]，具有较高的扩增效率、操作简单且适用范围广[29]。孙等人报道了一种结合哑铃形模板介导的指数级扩增与环状模板介导的线性扩增的双RCA级联策略，用于检测大肠杆菌O157:H7，其检测限为1.6 CFU/mL[30]。HCR是一种由熵驱动、无需酶的自发DNA组装过程，特别适用于复杂基质[31]。在HCR过程中，目标分子作为引物，组装出具有多个串联重复序列的双链DNA结构[32]，该结构可在电极表面延伸并结合大量信号分子以实现信号放大。

　　然而，单一的核酸扩增策略在扩增目标信号方面的效率有限。为克服这一局限，研究人员开发了级联策略，将两种或多种扩增技术相结合，利用协同效应大幅提升检测灵敏度并降低检测限[33,34]。例如，唐等人将APE1介导的环状扩增与CHA结合，用于检测牛奶中的枯草芽孢杆菌[35]； Kang等人则将指数级扩增与HCR相结合，实现了对坂崎肠杆菌的灵敏检测[36]。总体而言，级联扩增通过将多个核酸扩增反应串联起来，借助多级信号放大提升检测灵敏度。此外，通过合理设计的阶段间触发机制和反馈机制，不仅提高了检测的特异性，还减少了非特异性背景信号。

　　电化学传感器因其快速响应时间[37]、操作简单[38]、高灵敏度[39]以及低成本[40]等优势，在生物传感领域受到了广泛关注。但由于实际样本中的细菌浓度通常较低，电化学传感器往往需要与核酸信号扩增技术结合使用，以提高检测灵敏度，满足痕量分析的需求[41]。李等人报道了一种整合了DNA步行器、RCA和HCR的电化学生物传感器，可用于灵敏检测大肠杆菌O157:H7，其检测限为7 CFU/mL[42]；朱等人则开发了一种基于DNAzyme的比率型电化学生物传感器，并结合CHA扩增技术，实现了对鼠伤寒沙门氏菌的灵敏且特异的检测[43]。

　　级联扩增虽然能提升灵敏度，但由于涉及多步反应，也会增加系统的复杂性。为解决这一问题，本研究采用单一发夹结构来触发多步级联反应，既简化了流程，又进一步放大了信号。本研究基于针对单核细胞增生李斯特菌的特异性适配体，合理设计了发夹结构，有效降低了因自身切割产生的背景信号。通过巧妙设计额外的序列，将SDA、RCA和HCR相互连接，我们开发了一种基于发夹构象介导的SRH级联等温扩增电化学生物传感器，用于检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。简而言之，首先通过适配体特异性识别结合磁分离技术捕获目标细菌，将细菌浓度转化为触发DNA链（T）的浓度；这些T链会引发亚稳态发夹探针的构象变化，进而启动SDA反应并触发级联反应。大量的SDA产物（F）可作为引物，使锁形探针形成环状结构，而形成的环状DNA则会被固定在金电极上的Cap探针捕获。随后进行RCA反应，生成含有串联重复序列的长单链DNA，这些DNA会结合大量的引物I链，再与两个生物素标记的发夹结合，引发HCR反应，生成大量的双链DNA。通过生物素-链霉亲和素相互作用，将HRP连接到双链DNA上，催化OPD氧化，产生还原电流，从而实现定量检测。该策略已成功应用于生菜、奶酪和鸡肉样本中的单核细胞增生李斯特菌检测，检测结果与平板计数法一致。因此，这项工作为在复杂食品基质中快速、灵敏且特异地检测食源性病原体提供了一种有效方法。

　　本实验所需的材料与仪器信息详见补充资料。寡核苷酸的合成与纯化工作由上海桑根生物科技有限公司完成，完整的序列列表见表S1。

　　为了制备适配体/T双链分子（Apt/T），需将1 μL的单核细胞增生李斯特菌适配体（浓度为100 μM）、2 μL的T分子（浓度为100 μM）、1 μL的Mg^2+溶液（浓度为100 μM）以及6 μL的TE缓冲液混合，然后在95°C下孵育5分钟，之后缓慢冷却至室温。

　　用于检测单核细胞增生李斯特菌的发夹构象变化介导的SRH电化学生物传感器的原理如图1所示。如图1(A)所示，首先将磁珠与Apt/T双链复合物一起孵育，然后通过磁分离去除未结合的T分子。接着，将不同浓度的单核细胞增生李斯特菌与Apt/T复合物混合，此时适配体会特异性地捕获目标细菌，从而使T分子释放到上清液中。

　　本研究成功开发了一种基于发夹构象变化介导的级联等温扩增技术的电化学生物传感器，用于检测食品中的单核细胞增生李斯特菌。该方法通过适配体特异性识别及磁分离技术，将目标细菌的浓度转化为触发链的浓度。通过串联应用SDA、RCA和HCR三种扩增技术（即SRH策略），该系统充分利用了这三种技术的优势。

　　数据整理、正式分析、研究实施、方法设计、软件应用、结果验证、可视化处理、初稿撰写。

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